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不同非洲豬瘟病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的對(duì)比

一、簡(jiǎn)介

非洲豬瘟（Africann Swine Fever, ASF）是由非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）感染引起的家豬和野豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病¹。臨床癥狀與豬瘟極其相似，以高熱、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟器官嚴(yán)重出血、呼吸障礙和神經(jīng)癥狀為主要特征。本病傳播快、致死率高，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害巨大，是我國(guó)一類動(dòng)物疫病和世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，受到世界各國(guó)的高度重視²。本病是以節(jié)肢動(dòng)物作為傳播媒介的DNA病毒。ASF已在非洲、歐洲和美洲等幾十個(gè)國(guó)家暴發(fā)，“三全水餃?zhǔn)录?rdquo;則將非洲豬瘟直接推向大眾的面前。目前，本病尚無有效的預(yù)防疫苗和治療藥物，防止疫情擴(kuò)大的有效措施就是撲殺。因此事先建立簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的ASFV檢測(cè)方法顯得十分必要。本文就ASFV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的不同方法，進(jìn)行對(duì)比分析。

二、檢測(cè)方法

2.1 血清學(xué)檢測(cè)方法

2.1.1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA利用抗原抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)，應(yīng)用于血清抗體的檢測(cè)，適用于大批量樣品的檢測(cè)。ASFV含有約150種蛋白，目前國(guó)內(nèi)外常用作檢測(cè)抗原的蛋白有VP73、VP72、P54、P32、P30等³。

優(yōu)點(diǎn)：快速、方便。

缺點(diǎn)：（1）一般情況下, 非洲豬瘟病毒進(jìn)入豬體內(nèi)， 7天后才能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的Ig G抗體，而7天的時(shí)候，足以出現(xiàn)早期臨床癥狀，并已經(jīng)傳染給其他家豬，因此該檢測(cè)方法往往具有難以解決的滯后性。（2）針對(duì)不同蛋白會(huì)出現(xiàn)個(gè)別差異，增加排查的難度³。

2.1.2膠體金免疫層析（GICA）試紙條

運(yùn)用雙抗體夾心法原理純化后的抗ASFV單克隆抗體制備金標(biāo)抗體, 應(yīng)用于檢測(cè)ASFV的膠體金免疫層析試紙條，也稱為檢測(cè)卡。

優(yōu)點(diǎn)：使用方便；

缺點(diǎn)：（1）靈敏度低；（2）一般情況下, 非洲豬瘟病毒進(jìn)入豬體內(nèi)， 7天后才能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的Ig G抗體，而7天的時(shí)候，足以出現(xiàn)早期臨床癥狀，并已經(jīng)傳染給其他家豬，因此該檢測(cè)方法往往具有難以解決的滯后性³。

2.1.3熒光抗體試驗(yàn)（FAT）

熒光抗體試驗(yàn)（FAT）可用于檢測(cè)野外可疑豬或?qū)嶒?yàn)室接種豬的脾、淋巴結(jié)等組織壓片和冰凍切片中的ASFV抗原。

優(yōu)點(diǎn)：敏感性和特異性較佳；

缺點(diǎn)：需要專業(yè)試驗(yàn)人員，同時(shí)需要熒光顯微鏡及高質(zhì)量的熒光標(biāo)記抗體。因此僅作為ASFV的輔助檢測(cè)方法⁴。

2.1.4免疫組化法

該方法用來檢測(cè)急性感染ASFV豬的扁桃體組織病理學(xué)變化，通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，感染ASFV豬有出血、單核細(xì)胞增多現(xiàn)象。免疫組化法對(duì)于臨床癥狀不明顯的病例，確診有一定難度，因此，該方法僅作為ASFV的輔助檢測(cè)方法。

優(yōu)點(diǎn)：特異性較佳；

缺點(diǎn)：對(duì)于臨床癥狀不明顯的病例，確診有一定難度⁴。

2.2分子生物學(xué)檢測(cè)方法

2.2.1 PCR

體外擴(kuò)增基因的一種方法，是目前ASFV常用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。研究表明，非洲豬瘟感染8小時(shí)， 便可從血液中檢測(cè)到其核酸物質(zhì)，因此針對(duì)非洲豬瘟病毒保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，對(duì)采集的血液或組織病料等相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行DNA提取，進(jìn)行PCR反應(yīng)，可對(duì)其進(jìn)行快速準(zhǔn)確診斷。是目前ASFV常用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。眾多國(guó)內(nèi)外研究^5-9均建立了ASFV的PCR檢測(cè)方法，表明該方法具有良好的敏感性和特異性，且可以檢測(cè)出極低含量的ASFV，為ASFV早期感染的快速診斷提供了有效的分子生物學(xué)檢測(cè)方法。

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單快速、靈敏度高和特異性強(qiáng)。

2.2.2 熒光定量PCR

通俗講是PCR的升級(jí)版。實(shí)時(shí)熒光定量PCR比常規(guī)PCR具有更高的敏感性和特異性，可同時(shí)快速檢測(cè)大批量樣品，其更加敏感、準(zhǔn)確。舉例，McKillen等¹⁰（2010）根據(jù)9GL基因建立了MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，低可以檢測(cè)到20拷貝標(biāo)準(zhǔn)DNA。

優(yōu)點(diǎn)：敏感性和特異性高。

2.2.3 探針雜交技術(shù)

能有效排除PCR檢測(cè)過程中的非特異性結(jié)果， 省去了瓊脂糖凝膠電泳步驟，操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)迅速，在酶標(biāo)板中可批量反應(yīng)，為ASFV核酸檢測(cè)方法開辟了新的途徑，

該方法的建立難度較高、操作較繁瑣， 對(duì)實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)水平要求較高。

三、小結(jié)

• 目前，ASFV的檢測(cè)技術(shù)主要有針對(duì)病毒DNA的核酸檢測(cè)技術(shù)和基于病毒抗原、抗體反應(yīng)的免疫學(xué)技術(shù)兩大類。
• OIE推薦檢測(cè)ASFV的方法主要有PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、ELISA等。用免疫學(xué)方法檢測(cè)抗體可以了解ASFV感染、發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程，但抗體只有在病毒感染至一定時(shí)期后才會(huì)出現(xiàn)，故ELISA等抗體檢測(cè)方法存在一定的局限性和滯后性。
• PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等分子生物學(xué)技術(shù)在豬感染ASFV的早期即可檢測(cè)到病毒核酸，在ASFV的早期檢測(cè)中具有重要作用。
• 總之，ASFV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法多種多樣，但若要求檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、快速、敏感，我們推薦PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，這不僅對(duì)感染ASFV的動(dòng)物治療非常重要，而且對(duì)未感染的動(dòng)物及時(shí)采取有效的預(yù)防措施同樣具有重要的意義。

• 隨著免疫學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，ASFV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法必將不斷完善，進(jìn)一步為我國(guó)開展ASF的監(jiān)測(cè)與綜合防控提供技術(shù)支持。

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